トウキョウサンショウウオ（Hynobius tokyoensis)とヤマアカガエル（Rana ornativentris)は東京近郊の丘陵地帯の谷戸田では昔から人々に馴染みの深いよく知られた両生類である。しかしながら、両種とも近年各地で個体群の絶滅や衰退が激しく、東京都や環境省のレッドリストでも絶滅危惧または準絶滅危惧種として挙げられている。私は1970年代から東京都多摩地区にてトウキョウサンショウウオの調査研究を続けてきた。その際、比較的観察しやすい卵死亡率についても観察を続け、産卵場所や年度により異常に死亡率が高いケースがあることが少し気にかかっていた。このような卵死亡率の変異は、同じ産卵場内の年度間の変動（個体群内の時間的変異）と産卵場所間の地理的変異（個体群間変異）に分けて考える必要がある。今回は後者の個体群間の変異について、調査し解析した結果を紹介したい。なお本文は、Okamiya and Kusano (2018) の結果をもとに、独自に私が要約した。興味を持った方は、是非元の英語論文を参照してみてください。

 　以前から時々トウキョウサンショウウオについて、卵嚢はたくさん産卵されているが、多くの卵嚢の卵がほとんど死んでいるが何故かと聞かれることが 時々あった。私自身も1箇所の産卵場で一部の卵嚢ではほとんどすべての卵が死んでいるのを見ることは珍しくはなかったが、産卵されている卵嚢のほとんど全てで全滅している例を見るのはあまりなかったので、答えに窮した。たまたまその年、酸性雨などの影響で卵がほぼ全滅した可能性なども考えていた。ヤマアカガエルについては、卵死亡率は簡単には求められないので（なにしろ1卵塊の卵数が多く卵塊が球形なので内部の卵の状態がすぐには分からない）、定量的な数値としての記録もなく、漫然と死亡率はそれほど高くないだろうと考えていた。たまたま、同じ研究室の学生が南大沢のイモリ池でヤマアカガエルの研究を修士課程のテーマとしてすることになり、卵死亡率も1卵塊ごとに丁寧に全数カウントし正確な値を求めてくれた。それによると予想外に卵死亡率が悪く、平均4割弱が孵化できずに死んでいることが分かった。近隣の丘陵地帯で他の産卵場についても予備的に調べたところ、どこでも高いわけではなく場所により大きな変異があることが分かった。そこで、同じような止水の繁殖場を利用するトウキョウサンショウウオとヤマアカガエルの2種について、2015年から2016年により広範囲に詳しく繁殖集団の卵死亡率を埼玉県・東京都・神奈川県の1都2県でトウキョウサンショウウオは39箇所・ヤマアカガエルは42箇所で調査した(図2）。

　トウキョウサンショウウオについては、長期モニタリング調査の手順にも記述があるが、それぞれの調査地にて繁殖シーズンの終わり頃に卵のうごとに発生中の生存卵と死卵をカウントしした。ただし、尾芽胚以降の卵を含む卵のうだけを対象とした。発生がほとんど進んでいない球形のままの卵や途中で発生が止まっている卵は死卵と判定した（図1）。ヤマアカガエルの場合は、平均で1卵塊に1，500卵程度含まれるので、尾芽胚以降まで発生が進んだ卵を含む各卵塊から、無作為に200〜300卵程度（平均265）を選び生存卵と死卵をカウントした。一部の調査地では集団の遺伝的多様性を調べるためにDNAサンプルを採集し、後ほどミトコンドリアDNAとマイクロサテライトDNAの解析を行った。

図1. トウキョウサンショウウオの卵のう。左側の白くなっている胚は死亡卵、右側の多くの胚は孵化間近まで発生が進んでいる。

 

  

図2. 卵死亡率の調査地。左図：東京都、埼玉県、神奈川県の全調査域。右図：東京都多摩地区の拡大図。赤丸はトウキョウサンショウウオ、白十字はヤマアカガエルの調査地点を示す。

　トウキョウサンショウウオについては32集団（2,312卵のう）、ヤマアカガエルでは38集団（377卵塊）の平均卵死亡率を得ることができた。両種とも平均卵死亡率には集団間で大きな変異があり、それぞれ0〜45％（平均11％）、1〜48％（平均16％）であった（図3）。各集団の遺伝的多様度も卵死亡率同様に大きな集団間変異を示した。多様度の指標としては、H_E（平均期待ヘテロ接合度）とπ（塩基多様度）を用いた。

図3．関東南西部における卵死亡率の地理的変異。青丸はトウキョウサンショウウオ、赤丸はヤマアカガエルを示す。

　次に、このような集団の卵死亡率（及び遺伝的多様性）の大きな変異に影響する原因を推定するために、各産卵場周辺の生息環境を調べて卵死亡率・遺伝的多様度との関係を分析した。まず、気候要因として年平均気温・年降水量・日平均日射量・年日照時間、地形要因として標高・斜度・南向き斜面割合、土地利用に関する要因として森林面積割合・建物面積割合・水田面積割合・総道路延長距離を既存のGIS資料から求めた。これらの環境要因はすべて100m x 100m のメッシュに落として解析に用いた。両種の最大分散距離を500m程度と考え、各産卵場の中心に半径500mのバッファーを設定し、その中に含まれるメッシュの属性値の平均値を各当該集団に割り当てた。

　今回の解析では、卵死亡率と環境要因との間には、複雑な非線形関係が想定されるので、そのような関係の解析にも適した機械学習の一手法であるランダム・フォレスト（RF）モデルを適用した。目的変数とした卵死亡率及び遺伝的多様度は、各種ごとに別々に標準化した値（平均0、分散1）を解析に用いた。その結果、卵死亡率の変異に影響を与える要因は森林面積・建物割合・年平均気温・標高が重要であると推定され、特に土地利用の影響がが重要であることが分かった（図4）。遺伝的多様度に関しても、ほぼ卵死亡率と似たような結果となったが、特に地形要因の年平均気温と標高が高い値を示した。

図4．ランダム・フォレストによる各環境要因の重要度

　次に、重要と推定された環境要因と卵死亡率との関係を見てみたい。注目する要因以外の要因を一定に保ったときに、注目要因の変化に卵死亡率がどのように反応するかを推定した部分従属プロットを作成した（図5）。この図は縦軸に死亡率ではなく、平均孵化率（1-卵死亡率）をとったものなので、卵死亡率の挙動とは逆になっていることに注意してほしい。森林面積や建物割合といった土地利用に集団の卵死亡率が強く反応することが分かった。すなわち、繁殖集団の住む地域の周囲の環境が開発され森林面積が減少し建物割合が増えるに従い、繁殖集団の卵死亡率が上昇すると予想された。

図5．平均孵化率の各環境要因に対する反応（部分従属プロット）。縦軸の予測値は卵死亡率ではなく平均孵化率を示すことに注意。

　遺伝的多様度に関しても同様の環境要因との関係を見てみた（図6）。こちらは、土地利用というよりも地形要因に強く反応している。年平均気温が下がるに従い、急速に減少している。標高に関しては低地のほうがむしろ遺伝的多様度が低くなる傾向が出ている。

図6．遺伝的多様度の各環境要因に対する反応（部分従属プロット）

　今回解析した卵死亡率と遺伝的多様度の集団間の変異には、個体群サイズの減少や遺伝的多様度の喪失を通した複雑な相互作用が働いていると考えられるので、その関係をざっと概観するために、卵死亡率・遺伝的多様度・環境要因の間でパス解析の手法を用いてそれらの関係をより詳しく解析した。環境要因としては、RF解析で重要とされた要因を外生要因として導入し、卵死亡率と遺伝的多様度に加え個体群サイズを導入し、これらの間には因果関係を想定したモデルを用い、AICを基準にモデル選択を行った。その結果、最適なモデルは図7のようになった。孵化率（1-卵死亡率）と遺伝的多様度は森林面積から有意な影響を受け、さらに遺伝的多様度は孵化率にも有意に影響していることが分かる。森林面積は直接的だけでなく、遺伝的多様度を通して間接的にも孵化率に影響しているらしい。

図７．孵化率と遺伝的多様度とそれに影響を与える要因間の関係（パス図）。矢印の上の数字は標準化したパス係数。赤い矢印は有意な影響を表す。

　今回の調査及び解析で、東京近郊の丘陵地で繁殖する止水性の両生類トウキョウサンショウウオとヤマアカガエルは両種とも卵死亡率・遺伝的多様度に大きな集団間の変異が見られることが分かった。また、その変異には土地利用が大きく関わっていると推定された。周囲の森林面積割合がどのように具体的に卵死亡率や遺伝的多様度に影響しているかは、必ずしもまだ良くわかっていないが、両種の主要な生息地である丘陵地帯の開発にともなう森林面積の減少が両種の卵死亡率上昇と遺伝的多様度喪失を通して、個体群絶滅及び衰退のリスクを高めているのは間違いないであろう。今後は、これらのより具体的な関係を明らかにすることが、両種を含む含む丘陵地帯に生息する両生類個体群の保全を考える上で必要かと思う。

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